食品中合成着色剂主要是以人工方法进行化学合成的有机色素类，按其化学结构不同可分为偶氮类色素和非偶氮类色素，偶氮类色素按溶解性不同又可分为油溶性和水溶性两类。合成类色素中还包括色淀。
食品中合成着色剂的种类很多，国际上允许使用的有30余种，我国允许使用的主要有苋菜红、胭脂红、赤藓红、新红、玫瑰红、柠檬黄、日落黄、亮蓝、靛蓝、牢固绿等。
6.1高效液相色谱法
1)原理
食品中的合成着色剂经聚酰胺吸附法或液一液分配法提取后，制成水溶液，注入高效液相色谱仪，经反相色谱分离，根据保留时间定性和与峰面积比较进行定量。
利用高效液相色谱法测定食品中合成着色剂的最小检出量为：新红5ng、柠檬黄4ng、苋菜红6ng、胭脂红8ng、日落黄7ng、赤藓红18ng、亮蓝 26ng。当进样量为0.025g样品时，最低检出浓度分别为0.2、0.16、0.24、0.32、0.28、0.72、1.04mg／kg。
2)仪器和试剂
(1)仪器 高效液相色谱仪，带紫外检测器。
(2)试剂
⑴正己烷。分析纯。
⑵盐酸。分析纯。
⑶乙酸。
⑷甲醇：经滤膜(0.45μm)过滤。
⑸聚酰胺粉(尼龙6)：过200目筛。
⑹乙酸铵溶液(0.02mol／L)：称取1.54g乙酸铵，加水至1 000mL，溶解，经滤膜(0.45μm)过滤。
⑺氨水：量取氨水2mL，加水至100mL，混匀。
⑻甲醇一甲酸(6+4)溶液：量取甲醇60mL，甲酸40mL，混匀。
⑼柠檬酸溶液：称取20g柠檬酸(C6H8O7•H2O)，加水至100mL，溶解混匀。
⑽无水乙醇一氨水一水(7+2+1)溶液：量取无水乙醇70mL、氨水20mL、水10mL，混匀。
⑾三正辛胺正丁醇溶液(5％)：量取三正辛胺5mL，加正丁醇至100mL，混匀。
⑿饱和硫酸钠溶液。
⒀pH6的水：水加柠檬酸溶液调pH到6。
⒁合成着色剂标准溶液：准确称取按其纯度折算为100%质量的柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、新红、赤藓红、亮蓝、靛蓝各0.1000g，置100mL容量瓶中，加pH6的水到刻度。此溶液含着色剂1.00mg／mL。
⒂合成着色剂标准使用液：临用时合成着色剂标准溶液加水稀释20倍，经滤膜(0.45μm)过滤。配成每毫升相当50.0μg的合成着色剂。
3)操作步骤
(1)样品处理
①橘子汁、果味水、果子露、汽水等：称取20.0～40.0g，放入100mL烧杯中。含二氧化碳样品需要加热以驱除二氧化碳。
②配制酒类：称取20.0～40.0g，放l00mL烧杯中，加小碎瓷片数片，加热驱除乙醇。
③硬糖、蜜饯类、淀粉软糖等：称取5.00～10.00粉碎样品，放人l00mL小烧杯中，加水30mL，温热溶解，若样品溶液pH较高，用柠檬酸溶液调pH到6左右。
④巧克力豆及着色糖衣制品：称取5.00～10.00g放入100mL小烧杯中，用水反复洗涤色素，到巧克力豆无色素为止，合并色素漂洗液为样品溶液。
(2)色素提取
①聚酞胺吸附法：样品溶液加柠檬酸溶液调pH至6，加热至60℃，将1g聚酞胺粉加少许水调成粥状，倒入样品溶液中，搅拌片刻，以G3垂熔漏斗抽滤，用 60℃pH4的水洗涤3～5次，然后用甲醇一甲酸混合溶液洗涤3～5次(含赤藓红的样品用液一液分配法处理)，再用水洗至中性，用乙醇一氨水一水混合溶液解吸3～5次，每次5mL，收集解吸液，加乙酸中和，蒸发至近干，加水溶解，定容至5mL经滤膜(0.45μm)过滤，取l0μL。进行HPLC分析。
图8—6八种着色剂色谱分离图
1.新红；2.柠檬黄；3.苋菜红；
4.靛蓝；5.胭脂红；6.日落黄；
7.亮蓝；8.赤藓红
②液一液分配法(适用于含赤藓红的样品)：将制备好的样品溶液放入分液漏斗中，加2mL盐酸、三正辛胺正丁醇溶液(5％)10～20mL，充分振摇提取，静置分取有机相，重复提取2～3次，每次10mL，直至有机相无色，合并有机相，用饱和硫酸钠溶液洗2次，每次10mL，分取有机相，放于蒸发皿中，水浴加热浓缩至l0mL，转移至分液漏斗中，加60mL正己烷，混匀，加氨水提取2～3次，每次5mL，合并氨水溶液层(含水溶性酸性色素)，用正己烷洗 2～3次，分取氨水层加乙酸调成中性，水浴加热蒸发至近干，加水定容至5mL。
经滤膜(0.45μm)过滤，取10μL进高效液相色谱仪。如图8—6所示。
(3)高效液相色谱分析参考条件
①色谱柱：YWG-Cl8，10μm不锈钢柱，4.6mm×250mm。
②流动相：甲醇一乙酸铵溶液(0.02 mol／L)(pH4)。
③梯度洗脱：用浓度为20％～35％的甲醇洗脱5min；用浓度为35％～98％的甲醇5min；用浓度为98％的甲醇继续洗脱6min。
④流速：1mL／min。
⑤紫外检测器，波长254nm。
(4)测定 取相同体积样液和合成着色剂标准使用液分别注入高效液相色谱仪，根据保留时间定性，外标峰面积法定量。
4)结果计算
式中：
X——样品中着色剂的含量，mg／g；
m1——样液中着色剂的质量，μg；
V2——样品进样体积，mL；
V1——样品稀释总体积，mL；
m2——样品质量，g。
结果的表述：保留算术平均值的二位有效数，允许相对误差≤10％。
6.2薄层色谱法及纸色谱法
1)原理
水溶性酸性合成着色剂在酸性条件下，被聚酰胺吸附后与食品中的其他成分分离，经过滤、洗涤及在碱性溶液(乙醇一氨)中解吸附，再经薄层色谱法或纸色谱法纯化、洗脱后，用分光光度法进行测定，可与标准比较定性、定量。
2)仪器和试剂
(1)仪器
①可见分光光度计。
②微量注射器或血色素吸管。
③展开槽：25cm×6cm×4cm。
④层析缸。
⑤滤纸：中速滤纸，纸色谱用。
⑥玻砂漏斗G3(50mL)。
⑦抽气装置。
⑧恒温水箱。
⑨薄层板：5cm×20cm。
⑩电吹风机。
(2)试剂
⑴石油醚：沸程60～90℃。
⑵甲醇。
⑶聚酰胺粉(尼龙6)：200目，使用前于100℃洗化1h，放冷密封备用。
⑷硅胶G。
⑸硫酸(1+10)。
⑹甲醇一甲酸溶液(6+4)。
⑺氢氧化钠溶液(50g／L)。
⑻盐酸(1+10)。
⑼乙醇(50％)。
⑽乙醇一氨溶液：取1mL氨水，加乙醇(70%)至l00mL。
⑾pH6的水：用柠檬酸溶液(200g／L)调蒸馏水的pH至6。
⑿海砂、碎瓷片：先用盐酸(1+10)煮沸15min，用水漂洗至中性，再用氢氧化钠溶液(50g/L)煮沸15min，用水漂洗至中性，再于105℃干燥，储于具玻璃塞的瓶中备用。
⒀柠檬酸溶液(200g／L)。
⒁钨酸钠溶液(100g／L)。
⒂展开剂。
a.正丁醇一无水乙醇一氨水(1%)(6+2+3)：供纸色谱用。
b.正丁醇一吡啶一氨水(1％)(6+3+4)：供纸色谱用。
c.甲乙酮一丙酮一水(7+3+3)：供纸色谱用。
d.甲醇一乙二胺一氨水(10+3+2)：供薄层色谱用。
e.甲醇一氨水一乙醇(5+1+10)：供薄层色谱用。
f.柠檬酸钠溶液(25g／L)一氨水一乙醇(8+1+2)：供薄层色谱用。
⒃合成着色剂标准储备液：准确称取按其纯度折算为100％质量的柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、新红、赤藓红、亮蓝、靛蓝各0.100g，加少量pH为6的水溶解，再转移至100mL容量瓶中并定容至刻度。配制成的各着色剂标准储备液浓度为1.00mg／mL。
⒄合成着色剂标准使用液：临用时吸取合成着色剂标准溶液各5.0mL，分别置于50mL容量瓶中，加pH6的水稀释至刻度。此溶液每毫升相当于0.10mg着色剂。
3)操作步骤
(1)样品的处理
①果味水、果子露、汽水：称取50.0g样品于100mL烧杯中。汽水需加热驱除二氧化碳。
②配制酒：称取100.0g样品于100mL烧杯中，加碎瓷片数块，加热驱除乙醇。
③硬糖、蜜饯类、淀粉软糖：称取5.00或10.0g粉碎的样品，加30mL水，温热溶解，若样液pH较高，用柠檬酸溶液调至pH4左右。
④奶糖类：称取10.0g粉碎均匀的样品，加30mL乙醇一氨溶液溶解，置水浴上浓缩至约20mL，立即用硫酸溶液(1+10)调至微酸性，再多加1.0mL硫酸，然后加入1mL钨酸钠溶液，使蛋白质沉淀，过滤后，用少量水洗涤，收集滤液。再用柠檬酸调pH至4。
⑤蛋糕类：称取10.0g粉碎均匀的样品，加海砂少许，混匀，用热风吹干样品(用手摸已干燥即可)，加入30mL石油醚搅拌。放置片刻，倾出含脂肪的石油醚，如此重复处理三次，以除去脂肪。吹干后研细，全部倒人玻砂漏斗中，用乙醇_氨溶液提取色素，直至着色剂全部提完，以下按奶糖类自“置水浴上浓缩至约 20mL”起依法操作。
(2)吸附分离 将处理后所得的溶液加热至70℃，用柠檬酸溶液(200g／L)调pH至4，加入0.5～1.0g聚酰胺粉充分搅拌，使着色剂完全被吸附，如溶液还有颜色，可以再加一些聚酰胺粉。
将吸附着色剂的聚酰胺全部转入玻砂漏斗中抽滤，用已被柠檬酸酸化至pH4的70℃热水反复洗涤，每次20mL，边洗边搅拌。若含有天然着色剂，再用甲醇一甲酸溶液洗涤1～3次，每次20mL，至洗液无色为止。再用70℃热水充分搅拌、洗涤沉淀，至洗液为中性。然后用乙醇一氨溶液分次解吸全部着色剂，收集全部解吸液，于水浴上驱氨。
如果为单色，则用水准确稀释至50mL，用分光光度法进行测定。如果为多种着色剂的混合液，则进行纸色谱或薄层色谱法分离后测定，即可将上述溶液置水浴上浓缩至2mL后移入5mL容量瓶中，用乙醇(50%)洗涤容器，洗液并人容量瓶中并稀释至刻度。
(3)定性分析
①纸色谱法：取层析滤纸，在距底边2cm处用铅笔划一条点样线，于点样线上间隔2cm标记刻度。在每个刻度处分别点3～10μL样品纯化溶液和l～2μL 着色剂标准溶液，各点直径不超过3mm，悬挂于分别盛有正丁醇一无水乙醇一氨水(1％)(6+2+3)、正丁醇一吡啶一氨水(1％)(6+3+4)的展开剂的层析缸中，用上行法展开，待溶剂前沿展至15cm处，将滤纸取出于空气中自然晾干，与标准色斑移动的距离(Rf值)进行比较定性。如Rf值相同即为同一色素。
也可取0.5mL样液，在起始线上从左到右点成条状，纸的左边点着色剂标准溶液，依法展开，晾干后先定性后再供定量用。靛蓝在碱性条件下易褪色，可用甲乙酮一丙酮一水(7+3+3)展开剂。
②薄层色谱法。
薄层板的制备：称取1.6g聚酰胺粉、0.4g可溶性淀粉及2g硅胶G，置于合适的研钵中，加15mL水研匀后，立即置涂布器中铺成厚度为0.3mm的板。在室温晾干后，于80℃干燥1h，置干燥器中备用。
点样：在距离板底边2cm处将0.5mL样液，从左到右点成与底边平行的条状，板的左边点2μL色素标准溶液。
展开：苋菜红与胭脂红用甲醇一乙二胺一氨水(10+3+2)展开剂，靛蓝与亮蓝用甲醇一氨水一乙醇(5+1+10)展开剂，柠檬黄与其他着色剂用柠檬酸钠溶液(25g／L)一氨水一乙醇(8+1+2)展开剂。取适量展开剂倒人展开槽中，将薄层板放入展开，待着色剂明显分开后取出，晾干，与标准斑移动的距离 (Rf值)进行比较定性。如Rf值相同即为同一色素。
(4)定量分析
①标准曲线制备：分别吸取0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00mL胭脂红、苋菜红、柠檬黄、日落黄色素标准使用溶液，或0.0、 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL亮蓝或靛蓝色素标准使用溶液，分别置于10mL比色管中，各加水稀释至刻度。用1cm比色杯，以零管调节零点，于一定波长下(胭脂红510nm，苋菜红520nm，柠檬黄430nm，日落黄482nm，亮蓝627nm，靛蓝620nm)，测定吸光度，分别绘制标准曲线。
②样品的测定：将纸色谱的条状色斑剪下，用少量热水洗涤数次，直至提取完全，合并提取液于人10mL比色管中，冷却后加水至刻度。 -
将薄层色谱的条状色斑包括有扩散的部分，分别用刮刀刮下，移入漏斗中，用乙醇一氨溶液解吸着色剂，少量反复多次至解吸液于蒸发皿中，于水浴上挥去氨，移人10mL比色管中，加水至刻度，做比色用。
将上述样品液分别用1cm比色杯，以零管调节零点，按标准曲线绘制操作，在一定波长下测定样品液的吸光度，并与标准系列比较定量或与标准色列目测比较。
4)结果计算
式中：
X——样品中着色剂的含量，g／k；
m1——样品比色液中着色剂的质量，mg；
V1——样品解吸后总体积，mL；
V2——样液点板(纸)体积，mL；
m——样品的质量(或体积)，g(或mL)。
结果的表述：保留算术平均值的二位有效数
(信息来源：食品分析者)
